Государственная фармакопея Республики Беларусь -
Скачать (прямая ссылка):
Vo - объем эксклюзии, определенный по пику, соответствующему декстрану Vo ФСО на хроматограмме маркерного раствора ;
Vt - полный объем колонки, определенный по пику, соответствующему глюкозе на хроматограмме маркерного раствора;
Vi - объем элюирования для секции i, полученный для хроматограммы каждого из градуировочных растворов.
Г радуировку проводят, используя один из следующих методов.
Гоадуировка по градуировочному графику. По уравнению (1) для каждого из декстранов для градуировки рассчитывают коэффициент распределения Ктах, соответствующий максимальной высоте пика хроматограммы. На полулогарифмической бумаге строят зависимость значений Ктах (ось абсцисс) от молекулярной массы для максимальной высоты пика (Мтах) каждого из декстранов для градуировки и глюкозы (ось ординат). Через все полученные точки проводят первую градуировочную линию, экстраполируя ее из точки Ктах, полученной для декстрана 250 для градуировки ФСО, до более низких значений К, полученных для тех же стандартных растворов (см. Рис. 2.2.39.-1).
где:
Рис. 2.2.39.1. Пример градуировочного графика Пунктиром указана часть градуировочного графика, полученная экстраполированием. Горизонтальными линиями в нижней части рисунка указаны ширина и положения хроматографических линий, полученных для каждого декстрана для градуировки
Используя полученный первый градуировочный график, находят для всех значений К для всех хроматограмм соответствующие значения молекулярных масс М, получая в таком способе графическую зависимость для рассчета молекулярномассового распределения. Для всех декстранов для градуировки расчитывают среде массовую молекулярную массу Мю по уравнению (3), приведенному ниже. Градуировочный график может быть использован для расчетов, если расчеты значения Мю для каждого из декстранов для градуировки не отличаются от указанных в паспорте значений больше чем на 5% и средние отклонения для всех декстранов не превышает +3%. Если данные условия не выполняются, градуировочный график смещают вдоль оси ординат и повторяют вышеописанные операции пока рассчитанные и указанные в паспорте значения Мю будут отличаться не более чем на 5%.
Градуировка при помощи расчетного метода. При помощи уравнений (2) и (3), приведенных ниже, и подходящего метода (возможно использование итеративного метода Гаусса-Ньютона, модифицированного метода Хартли. Также возможно построение кривой при помощи компьютерных программ, которые используют принцип нелинейного регрессивного анализа) рассчитывают значения коэффициентов b1, b2, Ьз, b4 и b5, для которых полученные значения Мю могут отличаться не более чем на 5% от соответственных паспортных значений Мю для каждого декстрана для калибровки и должны быть 180+2 для глюкозы.
# При расчетах Мю глюкозы в уравнении (2) допускают К=1.
Мі = b5 + е
(b4 +b1 K1 +b2'Kl +b3'K,3 )
(2)
I (yMi)
M w = J±L
^ (3)
I Уі
i=1
M w = —
I( yMi)
^ ’ (4)
I Уі
i=1
где:
р - число секций, на которые поделена хроматограмма;
уі - высота хроматографической линии над базовой линией в i-той секции;
Мі - молекулярная масса для секции /.
ПРИГОДНОСТЬ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ
Хроматографируют выбранный объем соответствующего раствора для проверки пригодности хроматографической системы.
Средняя молекулярная масса декстрана для проверки пригодности ФСО. Рассчитывают значение Mw, как указано в разделе «Градуировка хроматографической системы» используя или градуировочный график, или значения коэффициентов bi, b2, b3, b4 и b5. Результаты анализа считаются достоверными, если полученное значение Mw находится в пределах:
- от 41000 до 47000 (для декстрана 40 для проверки пригодности ФСО);
- от 67000 до 75000 (для декстрана 60/70 для проверки пригодности ФСО).
Средняя молекулярная масса 10% высокомолекулярной фракции декстрана. Значение Мw для 10% высокомолекулярной фракции декстрана, которая элюируется в секциях от 1 до n включительно, рассчитывают по формуле:
I ( УіМі )
Mw = J=L
11
I У‘
(4)
i=1
где:
n - номер секции, для которой выполняются неравенства:
n f p ^
S у і ? 0,1 S у-
i=1 V i=1 0
n+1 f p ^
S у- >0,1 S у- ¦
i=1 V і =1 0
